解放军总医院生物治疗科韩为东团队最新研究，PD-1的沉默会明显抑制CAR-T细胞的增殖能力
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◆采用功能特化的CART为模式细胞，研究长期的部分抑制PD1（不同于KO， 属于非完全抑制，更近似于模拟在体长期使用anti-PD1的效应）对T细胞分化发育以及功能的影响；
◆提示抗PD-1疗法，对肿瘤讲短期看是好事，对健全的免疫系统来讲，长期看有“竭泽而渔”的嫌疑。
2019年8月12日/峰客访谈 FENGClub/--近日，解放军总医院生物治疗科韩为东团队在Journal for ImmunoTherapy of Cancer (IF=8.7)杂志上发表了名为“PD-1 silencing impairs the anti-tumor function of chimeric antigen receptor modified T cells by inhibiting proliferation activity”的文章，报道了他们关于PD-1功能的最新研究成果。
▲解放军总医院生物治疗科韩为东教授
关于PD-1，在传统和主流的认知中，它被认为是抑制T细胞活化和增殖的关键受体，阻断PD-1信号被认为可以提高T细胞的抗肿瘤功能。
但在本研究中，研究人员发现，稳定敲低PD-1的表达后，CAR-T细胞的体内和体外抗肿瘤功能并没有显著提高，反而有所降低。通过进一步研究发现，PD-1的沉默会明显抑制CAR-T细胞的增殖能力。
如文章中图4D和4E所示，在培养状态下，PD-1沉默CAR-T细胞的倍增时间可达到正常CAR-T细胞的15倍以上；如图4B和4G所示，在靶细胞刺激下，PD-1沉默CAR-T细胞的增殖能力也仅仅有正常CAR-T细胞的1/3—1/5左右。
图片来源：Wei et al. Journal for ImmunoTherapy of Cancer (2019) 7:209
https://doi.org/10.1186/s40425-019-0685-y
随后研究人员证实，PD-1敲低并不会诱导CAR-T细胞的衰竭，反而在一定程度上可以延缓衰竭。但是，PD-1的敲低会明显加速T细胞从原始状态向效应状态的分化，作者认为这可能是造成T细胞增殖能力受损的主要原因。
这篇文章提示我们，PD-1可能在维持T细胞的正常增殖和分化中起着重要作用，而PD-1的沉默会通过抑制T细胞的增殖而损害其抗肿瘤功能。
文章发表后，医麦客峰客访谈记者联系到了本文第一作者魏建树博士，并对几个我们关心的问题进行了提问和讨论：
峰客访谈：我们关注到，之前有几篇文章报道利用Crispr/Cas9技术敲除PD-1基因以后，CAR-T细胞的抗肿瘤功能得到了明显增强，这与本文的结论是不一致的，您认为可能的原因是什么？
魏建树博士：首先，其他研究用的靶细胞大多数是PD-L1过表达的，这种均一的、高水平的PD-L1对正常T细胞的功能抑制是非常强的。我们用的是敲低的方法，T细胞中肯定还会残留一部分PD-1的表达，这部分残留的PD-1仍然可以对T细胞产生明显的抑制作用，而敲除则可以完全去除这种抑制作用。
T细胞的抗肿瘤功能是由多个因素共同决定的，即使它的增殖能力变弱，但如果完全解除了PD-L1介导的免疫抑制，那它整体上表现出更强的抗肿瘤活性也是有可能的。
其次，PD-1其实是一个比较复杂的受体，比如，它包含ITSM 和ITIM两类功能域，ITIM区在激活的时候也会磷酸化，但是目前并没有发现它具有招募下游抑制性因子的功能。所以说，PD-1除了抑制T细胞激活以外，还可能存在其他的功能，而这部分功能可能是本底水平的，不需要外源配体参与的。像这种比较复杂的蛋白，敲低和敲除产生出不同的影响，也是有人报道过的。
峰客访谈：关于PD-1功能的研究是一个非常热的领域，我们注意到，PD-1沉默对CAR-T细胞增殖能力的影响非常明显，这么明显的一个现象为什么其他研究组没有发现呢？
魏建树博士：我们认为部分原因是大家关心的重点不同。在众多基因修饰PD-1的文章中，大家主要还是以转化为目的，是为了敲除PD-1应用到临床提供基础数据支持。在这种情况下，大家更关心的可能是整体的抗瘤功能是否得到了增强，而不会去着重研究它的增殖情况。因为PD-1的表达是动态变化的，所以用CRISPR等技术敲除PD-1后，被成功基因编辑的T细胞是无法做到适时追踪的。所以，即使在PD-1敲除模型中，CAR-T细胞的增殖也受到了抑制，这个现象是比较难以观察到的。
其实，在我们这个实验开始的初期，我们也没有把增殖作为重点的研究内容。但是，我们所采用的实验体系非常方便我们去直观的追踪PD-1沉默的CAR-T细胞，因为每个ZsGreen阳性的细胞都是CAR阳性且PD-1被敲低的。
峰客访谈：既然阻断PD-1会抑制T细胞的增殖能力，那这是不是意味着PD-1抗体药物在临床上也会受到限制呢？
魏建树博士：PD-1抗体药物的临床效果是毋庸置疑的，无数的临床数据已经证明了这一点。在我们的实验中，我们发现PD-1抗体并不会对T细胞的表型、增殖、分化产生任何显著的影响。一个是外源阻断，一个是内源阻断，这两者之间的区别还是很明显的。这也许也间接证明了一个可能性，那就是PD-1除了抑制效应以外，在维持T细胞的正常分化和增殖方面也具有重要的功能，而这部分功能的发挥可能是不需要配体参与的。